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                技術文章首頁 > 技術文章 > 抗體偶聯藥物ADC - 連續流合成
                抗體偶聯藥物ADC - 連續流合成
                點擊次數:396 發布時間:2022-09-28

                研究背景


                抗體偶聯藥物(ADC,Antibody-drug conjugates),是將類似于化療的細胞毒性藥物與單克隆抗體連接在一起,從而實現對腫瘤組織的靶向殺傷功能。其結合了靶向療法和化療療法的作用原理,具有靶向性高,特異性強,毒副作用小等優點。


                早在2015年,Jones團隊利用流動化學實現通過小分子標簽加工蛋白質(包括抗體)的可行性,并成功地利用直接的一步生物偶聯天然賴氨酸側鏈,對蛋白質和抗體進行修飾。( 請參考:J. Flow Chem. 2015, 5, 151-154)


                但在ADC中,由于抗體中有超過80個暴露的且具備反應活性的賴氨酸殘基。如此多的活性位點會使得偶聯反應產生多種偶聯混合物。ADC的連續化合成目前未見有報道。


                結合之前Jones的工作,研究者決定嘗試以連續流反應器合成ADC。


                ADC合成概述


                通過半胱氨酸等內源性氨基酸,在二硫鍵間的連接位點合成ADC是一種常見的方法。這種偶聯方法需要對蛋白質分子進行氧化還原,以釋放活性硫醇部分。


                該生物偶聯過程可分為兩個步驟: 通過三(2-羧乙基)膦(TCEP)還原抗體,然后巰基與馬來酰亞胺藥物偶聯(如圖1)。

                圖片

                圖1. 半胱氨酸基ADC的合成方案


                這種偶聯技術具有優勢,因為其控制的藥物-抗體比(DAR)(典型DAR值在3.5 - 8之間)和相對較低的異質性,目前主要使用傳統的間歇反應器進行合成。


                作者使用連續流反應器和傳統的含馬來酰亞胺藥物連接劑生產ADC,開發出一種連續制備9個半胱氨酸偶聯ADC的工藝(圖2),在幾分鐘內從天然抗體實現ADC合成,且所得ADC的目標DAR和聚集特性與市售ADC相似。


                DAR簡介


                DAR(Drug-to-Antibody Ratio,藥物抗體比值)是抗體藥物偶聯物的一個關鍵屬性,是ADC藥物研發過程重要的質控環節。ADC藥物從本質上講是混合物,是由連接不同個數小分子藥物的單抗組成。


                DAR代表的是每個單抗上連接小分子藥物的平均數量。DAR直接影響ADC藥物的療效和安全性,藥物研發階段應盡量縮小DAR值的變動區間。



                研究過程

                一. 連續流工藝


                作者基于之前使用連續流反應器的經驗,此次使用的是V型混合器+管式反應器。實驗設計時,除了考量反應時間和溫度,管式反應器的長度也是此次工藝優化的關鍵變量。


                圖片

                圖2. 連續流合成流程圖


                管式反應器的長度直接影響反應時間(反應器1用于TCEP還原,反應器2用于藥物偶聯。  因此,作者評估了反應器長度和產生的ADC的 DAR之間的關系(表1)。


                在初步可行性研究中,作者選擇曲妥珠單抗(Trastuzumab)和藥物連接劑MMAE進行偶聯。通過反相高效液相色譜(RP)分析,將間歇反應器和連續流法生產的ADC進行了直接比較。


                圖片

                表1. 間歇式反應器和連續化反應結果比對


                二. 工藝條件研究


                • 在間歇法的生物偶聯中,通常需要超過1小時的時間來完成ADC偶聯步驟。

                • 而使用管式反應器,在37℃下進行3min TCEP還原,然后在25℃下偶聯藥物 3min,得到的ADC的測量DAR值為3.2(表1,條目1)。

                • 當偶聯反應時間降低到1.5 min時,得到的ADC的DA值R沒有變化(表1,條目2)。

                • 偶聯時間進一步降低到0.75 min也沒有顯著降低,但將Reactor-2停留時間降低到0.38 min,得到的ADC的DAR值小于2。

                • 還原步驟(Reactor-1)的時間從3min減少到1.5min也導致ADC的DAR值小于2。


                三. 反應底物的拓展


                作者進一步評估了其他抗體和藥物連接子,以驗證連續流化學方法合成ADC的普遍性和可靠性。


                如表2所示:通過連續流反應器,作者制備9個半胱氨酸偶聯ADC,都取得了不錯的結果。

                圖片

                表2. 底物拓展研究實驗


                總結


                • 使用連續流技術實現ADC合成;

                • 通過優化反應時間,溫度等因素,開發了9種ADC的連續流合成工藝;

                • 連續流動化學可用于開發一種可靠而穩健的ADC生產工藝;

                • 連續流工藝可與間歇式生產的ADC相媲美,并顯著縮短反應時間;

                • 連續流工藝易于放大的特點,更容易實現放大生產。

                參考文獻:Org. Process Res. Dev. August 31, 2022


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